Өнімдер
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR 2019-nCoV анықтау жинағы
Күтілетін пайдалану
Бұл жинақ жаңа коронавирусты (2019-nCoV) жұлдыру жағындыларын, мұрын-жұтқыншақ жағындыларын, бронх-альвеолярлы жуу сұйықтығын, қақырықты пайдаланып сапалы анықтау үшін пайдаланылады. Бұл өнімнің анықтау нәтижесі тек клиникалық анықтама үшін ғана берілген және оны жалғыз вирус ретінде қолдануға болмайды. клиникалық диагностика мен емдеудің дәлелі. Жағдайды жан-жақты талдау науқастың клиникалық көріністерімен және басқа зертханалық зерттеулермен бірге ұсынылады.
Тексеру принципі
Жинақ бір сатылы RT- ПТР технологиясына негізделген.Іс жүзінде 2019 жылғы жаңа коронавирус (2019-nCoV) ORF1ab және N гендері күшейтудің мақсатты аймақтары ретінде таңдалды.Арнайы праймерлер мен флуоресцентті зондтар (N гендік зондтар FAM және ORF1ab зондтары HEX белгісімен таңбаланады) үлгілерде 2019 жаңа типті коронавирус РНҚ анықтауға арналған.Жинақ сонымен қатар үлгілерді жинау, РНҚ және ПТР күшейту процесін бақылау үшін, осылайша жалған теріс нәтижелерді азайту үшін эндогендік ішкі бақылауды анықтау жүйесін (CY5 белгісімен белгіленген ішкі бақылау генінің зондын) қамтиды.
Негізгі компоненттер
| Құрамдас бөліктер | Көлемі（48Т/жинақ） |
| RT-ПТР реакциясының ерітіндісі | 96 мкл |
| nCOV праймері TaqMan зонд қоспасы (ORF1ab, N гені, RnaseP гені) | 864 мкл |
| Теріс бақылау | 1500мкл |
| nCOV оң бақылау（l ORF1ab N ген） | 1500мкл |
Меншікті реагенттер: РНҚ экстракциясы немесе тазарту реагенттері.Теріс/оң бақылау: оң бақылау – мақсатты фрагментті қамтитын РНҚ, ал теріс бақылау – нуклеин қышқылы жоқ су.Қолдану кезінде олар экстракцияға қатысуы керек және жұқпалы деп саналуы керек.Олар тиісті ережелерге сәйкес өңделуі және жойылуы керек.
Ішкі анықтамалық ген адамның RnaseP гені болып табылады.
Сақтау шарттары және жарамдылық мерзімі
-20±5℃, 6 ай бойы жарамды 5 реттен көп қайталанатын мұздату мен ерітуден аулақ болыңыз.
Қолданылатын құрал
FAM / HEX / CY5 және басқа көп арналы флуоресцентті ПТР құралымен.
Үлгіге қойылатын талаптар
1. Қолданылатын үлгі түрлері: жұлдыру жағындылары, мұрын-жұтқыншақ жағындылары, бронх-альвеолярлы жуу сұйықтығы, қақырық.
2. Үлгіні жинау (асептикалық әдіс)
Жұтқыншақ жағындысы: Бадамша бездері мен жұтқыншақтың артқы қабырғасын бір уақытта екі тампонмен сүртіңіз, содан кейін жағынды басын сынама алу ерітіндісі бар пробиркаға батырыңыз.
Қақырық: Науқас терең жөтелден кейін жөтел қақырықты сынама алу ерітіндісі бар бұрандалы қақпақшалы пробиркаға жинаңыз;бронхоальвеолярлы шаю сұйықтығы: Медицина мамандары сынама алу.3. Үлгілерді сақтау және тасымалдау
Вирусты оқшаулауға және РНҚ сынауға арналған үлгілерді мүмкіндігінше тезірек сынау керек.24 сағат ішінде анықталатын үлгілерді 4℃ температурада сақтауға болады;24 ішінде анықталмайтындар
сағат -70 ℃ немесе одан төмен температурада сақталуы керек (егер -70 ℃ сақтау шарты болмаса, олар
-20℃ тоңазытқышта уақытша сақталады).Үлгілерді тасымалдау кезінде қайталап мұздатудан және ерітуден аулақ болу керек.Үлгілерді жинағаннан кейін мүмкіндігінше тезірек зертханаға жіберу керек.Үлгілерді ұзақ қашықтыққа тасымалдау қажет болса, құрғақ мұзды сақтау ұсынылады.
Сынақ әдістері
1 Үлгіні өңдеу және РНҚ экстракциясы (үлгіні өңдеу аймағы)
РНҚ экстракциясы үшін 200 мкл сұйықтық үлгісін алу ұсынылады.Қатысты экстракция қадамдары үшін коммерциялық РНҚ экстракция жинақтарының нұсқауларын қараңыз.Теріс және теріс
шығаруға осы жинақтағы басқару элементтері тартылды.
2 ПТР реагентін дайындау (реагент дайындау аймағы)
2.1 Жинақтан барлық компоненттерді алып тастаңыз және бөлме температурасында ерітіңіз және араластырыңыз.Қолданар алдында бірнеше секунд бойы 8000 айн/мин центрифугалаңыз;реагенттердің қажетті мөлшерін есептеп, реакция жүйесі келесі кестеде көрсетілгендей дайындалады:
| Құрамдас бөліктер | N порция (25 мкл жүйе) |
| nCOV праймер TaqMan зонд қоспасы | 18 мкл × Н |
| RT-ПТР реакциясының ерітіндісі | 2 мкл × Н |
| *N = сыналған үлгілер саны + 1 (теріс бақылау) + 1 (nCOVоң бақылау) | |
2.2 Компоненттерді мұқият араластырғаннан кейін түтік қабырғасындағы барлық сұйықтық түтік түбіне түсуі үшін қысқа уақыт центрифугалаңыз, содан кейін ПТР түтігіне 20 мкл күшейту жүйесін аликвоталаңыз.
3 Сынама алу (үлгіні дайындау аймағы)
Экстракциядан кейін 5 мкл теріс және оң бақылау элементтерін қосыңыз.Сыналатын үлгінің РНҚ ПТР реакция түтігіне қосылады.
Түтіктің қақпағын мықтап жабыңыз және оны күшейтуді анықтау аймағына тасымалдамас бұрын бірнеше секунд бойы 8000 айн/мин центрифугалаңыз.
4 ПТР күшейту (күшейтілген анықтау аймағы)
4.1 Реакция түтігін құралдың үлгі ұяшығына салып, параметрлерді келесідей орнатыңыз:
| кезең | Цикл саны | Температура(°C) | Уақыт | жинақсайт |
| Керітранскрипция | 1 | 42 | 10 мин | - |
| Алдын ала денатурацияn | 1 | 95 | 1мин | - |
| Цикл | 45 | 95 | 15с | - |
| 60 | 30с | деректер жинау |
Құралды анықтау арнасын таңдау: флуоресценция сигналы үшін FAM、HEX、CY5 арнасын таңдаңыз.Анықтамалық флуоресцентті NONE үшін ROX таңдамаңыз.
5 Нәтижені талдау (Орнату үшін әрбір құралдың эксперименттік нұсқауларын қараңыз)
Реакциядан кейін нәтижелерді сақтаңыз.Талдаудан кейін кескінге сәйкес негізгі сызықтың бастапқы мәнін, аяқталу мәнін және шекті мәнін реттеңіз (пайдаланушы нақты жағдайға сәйкес реттей алады, бастапқы мәнді 3~15, аяқталу мәнін орнатуға болады) 5~20, реттеу) логарифмдік графикте Терезенің табалдырығында шек сызығы логарифмдік фазада, ал теріс басқарудың күшейту қисығы түзу немесе шекті сызығының астында).
6 Сапалық бақылау（Процедуралық бақылау сынаққа кіреді） Теріс бақылау: FAM, HEX, CY5 анықтау арналары үшін айқын күшейту қисығы жоқ.
COV оң бақылау: FAM және HEX анықтау арналарының айқын күшейту қисығы, Ct мәні≤32, бірақ CY5 арнасының күшейту қисығы жоқ;
Жоғарыда аталған талаптар бір тәжірибеде бір мезгілде орындалуы керек;әйтпесе эксперимент жарамсыз және қайталау қажет.
7 Нәтижелерді анықтау.
7.1 Егер сынақ үлгісінің FAM және HEX арналарында күшейту қисығы болмаса немесе Ct мәні > 40 болса және CY5 арнасында күшейту қисығы болса, 2019 жаңа коронавирус (2019-nCoV) жоқ деп айтуға болады. үлгідегі РНҚ;
.2 Егер сынақ үлгісінің FAM және HEX арналарында айқын күшейту қисықтары болса және Ct мәні ≤40 болса, үлгіні 2019 жылғы жаңа коронавирус (2019-nCoV) үшін оң деп бағалауға болады.
7.3 Егер сынақ үлгісінде тек FAM немесе HEX арнасының бір арнасында анық күшейту қисығы болса және Ct мәні ≤40 болса және басқа арнада күшейту қисығы болмаса, нәтижелерді қайта тексеру қажет.Қайта сынақ нәтижелері сәйкес болса, үлгіні жаңасына оң деп бағалауға болады
коронавирус 2019 (2019-nCoV).Қайта сынау нәтижесі теріс болса, үлгі 2019 жылғы жаңа коронавирусқа (2019-nCoV) теріс деп айтуға болады.
Позитивті бағалау мәні
ROC қисық әдісі жинақтың анықтамалық CT мәнін анықтау үшін қолданылады және ішкі бақылаудың анықтамалық мәні 40.
Тест нәтижелерін интерпретациялау
1.Әрбір эксперимент теріс және оң бақылаулар үшін тексерілуі керек.Сынақ нәтижелерін бақылау сапаны бақылау талаптарына сай болғанда ғана анықталуы мүмкін
2. FAM және HEX анықтау арналары оң болғанда, CY5 арнасының нәтижесі (ішкі басқару арнасы) жүйе бәсекелестігіне байланысты теріс болуы мүмкін.
3.Ішкі бақылау нәтижесі теріс болса, t пробирканың FAM және HEX анықтау арналары да теріс болса, бұл жүйенің өшірілгенін немесе жұмыс дұрыс емес екенін білдіреді, t сынақ жарамсыз.Сондықтан үлгілерді қайта тексеру қажет.
